Vivaflow® 200:用于杂交瘤上清液浓缩的关键性样本制备工具

摘要

本研究的重点是在进行亲和色谱前使用Vivaflow^® 200切向流膜包对多达3 L的鼠杂交瘤澄清上清液进行10倍浓缩。研究发现，同时使用两块Vivaflow^® 200 (截留分子量 (MWCO) 30 kDa) 时，抗体回收率始终超过98%，浓缩速度约为20 – 25 mL/分。

简介

采用杂交瘤技术生产的单克隆抗体在 (生物) 制药行业、研究以及体外诊断 (IVD) 产品的生产中均有广泛应用。诸如蛋白质免疫印迹、免疫荧光和ELISA等分析技术应用广泛。生产和加工单克隆抗体——特别是为IVD市场用户生产需要一些保证优质的措施，如实施ISO 9001质量体系以及采用最新的技术。

抗体生产中一个不可缺少的步骤就是使用超滤和微滤膜进行过滤 (1, 2)。搅拌加压过滤曾是最常用的实验室浓缩方法，浓缩体积不到500 mL。以往的常见问题包括速度慢、泡沫过多以及缺少死体积保留导致抗体大量丢失。这迫使生产科学家寻找实验室规模的正切流动过滤 (TFF) 方法。

使用微滤或超滤膜进行TFF广泛用于蛋白和抗体的澄清、浓缩或缓冲液更换 (3, 4)。原料横向流过滤膜 (正切)。在超滤模式下，低分子量分子通过滤膜滤出到滤液，而包含目标抗体的原料则可在很短的时间里不断浓缩到相对较高的蛋白浓度。

图1：Vivaflow^® 200正切流动膜包 (A) 及样本容器 (B)、蠕动泵 (C) 和滤液收集瓶 (D)。

稳定、可靠、可重复的样本制备 (如蛋白和抗体浓缩/缓冲液更换) 是所有生物试剂下游加工过程的基础步骤。在BioservUK，Vivaflow^® 200循环流道膜包一直是首选的浓缩工具，用于蛋白A或蛋白G制备色谱前杂交瘤澄清上清液原料的浓缩，最大体积可达3 L。选择超滤浓缩器时应考虑以下参数：超滤膜的质量、浓缩速度、抗体回收率、可重复使用性和成本效益。

在本文中，我们介绍了在BioservUK使用切向流动工艺对不同鼠IgG单克隆抗体亚类进行浓缩的情况。

材料和方法

图2：在BioservUK对3 L杂交瘤原料进行下游加工的工作流程。

上清液来自杂交瘤细胞，后者由鼠B淋巴细胞和Sp2.0小鼠骨髓瘤细胞系融合而成，并进行转瓶培养。杂交瘤细胞常规培养在添加了欧盟批准的10%胎牛血清 (Gibco货号：10270-106) 的RPMI 1640培养基 (Gibco货号：21875) 中。将一种原料在4至8°C下以8,000 g的离心力离心10分钟，进行澄清。用2 L水预先清洗VF200，以去除储存缓冲液。预先清洗过程中检查Vivaflow^® 200的完整性，时间在1分钟以上，确保滤液流速> 55 mL/分钟。

然后用两个并行连接的Vivaflow^® 200 (30 kDa MWCO，PES，Sartorius货号：VF20P2) 和15号泵头将上清液浓缩10倍 (图1)。细胞培养液中抗体浓度通常约为30 mg/L。经过Vivaflow^® 200处理后抗体浓度一般约为300 mg/L (10倍浓缩)。

Vivaflow^® 200浓缩器最大流速以3个大气压限值指示。抗体浓缩后，将膜包用2 L水清洗，然后在再循环模式下用500 ml 0.5 M NaOH和1%次氯酸钠溶液原位清洗 (CiP) 40分钟。随后用2 L水冲洗膜包，最后加入200 ml 20%乙醇，在2– 8°C下储存。将300 mL浓缩液在3,500 g下离心10分钟，进一步去除颗粒物，然后用500 ml Sartolab RF真空滤器 (Sartorius货号：180C2-E) 进行0.22 μm过滤，之后进行蛋白G HiFliQ 5 mL柱纯化 (蛋白Ark货号：HiFlIQ5-PG-5)。

结果

我们所有1– 3 L样本浓缩步骤的标准操作规程 (SOP) 中均包含Vivaflow^® 200。该仪器使用极其简便，浓缩速度约为20 – 25 mL/分时抗体回收率始终> 98%。重要的是，不可回收的滞留体积不到1 ml，十分理想，即使清洗步骤中压力指示灯亮起也不影响回收率。整套独立式系统可方便地与Masterflex Easy-Load蠕动泵头连接和断开，能够储存在冰箱中，随时重复使用，无需手动调节。该系统无需手工操作，干净清爽。

我们每20分钟监测一次流速，方法是在蠕动泵恒定速度下测定滤液体积。相应的Masterflex L/S Economy Drive蠕动泵设置为3。图4显示了通常的流速，在20–25 mL/分范围内。将3 L样本浓缩10倍一般需要2小时。

在BioservUK，我们建立了Vivaflow^® 系统，适用于不同的免疫球蛋白G (IgG) 亚类。所有鼠IgG亚类 (IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3) 的回收率均超过98%。每完成3L样本制备就进行一次原位清洗。各个Vivaflow^® 200膜包仅用于一种特定的IgG亚类。我们的SOP允许每个膜包的最大产量为50 L。

图3：不同时间测得的流速实例为过滤体积的函数

结论

Vivaflow^® 200正切流动膜包使用简便、流速快、成本低、通量高，且具有广泛的化学相容性和总体耐用性，因此，我们围绕该过滤浓缩步骤进行了1– 3 L杂交瘤培养液的下游加工。而在搅拌加压过滤装置中，使用的水平薄膜盘导致免疫球蛋白G在膜表面结块，从而使得流速显著降低，IgG损失可达40%。

我们得出的结论是，Vivaflow^® 200是一款独特的实验室规模TFF耗材，研究表明这些横向流动膜包是一种不可或缺的工具，适用于各种亚类的单克隆IgG的浓缩。对于体积最高达3 L的样本而言，Vivaflow^® 200仍是我们的首选，它是一款单克隆抗体级的超滤浓缩器。

参考文献1. Kemken R et al (1997) Dynamic membrane filtration inmammalian cell culture harvest. In: Carrondo MJT, Griffiths B,Moreira JLP (eds) Animal Cell Technology. Springer, Dordrecht.2. Bertera R, Steven H, Metcalfe M (1984) Development Studiesof crossflow filtration, The Chemical Engineer. 401: 10.3. Velez D, Miller L, MacMillan JD (1989) Use of tangentialflow filtration in perfusion propagation of hybridoma cellsfor production of monoclonal antibodies. Biotech & Bioeng,33 (7): 938.4. Van Reis R et al (1997) high performance tangential flowfiltration. Biotech & Bioeng, 56 (1): 71.

免责声明实验和方法均已独立完成，作者对本文全部内容负责。

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